کیت استخراج DNA بافت

* آماده سازی بافر PW1 و PW2 و محلول پروتئیناز K قبل از اولین استفاده:

قبل از اولین استفاده:

در کیت های 4 عددی

• مقدار ml7/1 اتانول (96-100) درصد به محلولPW1 Buffer  و ml2  به محلول PW2 Buffer اضافه کنید و سپس لیبل روی ظرف ها را علامت گذاری کنید.
• قبل از اولین استفاده μl100 از محلول پروتئیناز K یا μl100از ddH₂O را به ویال حاوی پروتئیناز K اضافه کنید و سپس به آرامی ویال را ورتکس کرده تا محلول به خوبی حل گردد.

در کیت های50 عددی

• مقدار ml34 اتانول (96-100) درصد به محلولPW1 Buffer  و  ml47 به محلول PW2 Buffer اضافه کنید و سپس لیبل روی ظرف ها را علامت گذاری کنید.
• قبل از اولین استفاده ml1 از محلول پروتئیناز K یا ml1 از ddH₂O را به ویال حاوی پروتئیناز K اضافه کنید و سپس به آرامی ویال را ورتکس کرده تا محلول به خوبی حل گردد.

نکات مهم:

1. ویال پروتئیناز K را در دمای -20°C نگهداری کنید. قبل از اولین استفاده حجم مورد نیاز محلول پروتئیناز K را به ویال پروتئیناز K اضافه کنید. سپس ورتکس کرده و مطمئن شوید که پروتئیناز K کاملاً حل شده است.
2. حجم مورد نیاز اتانول (96-100) درصد را در اولین استفاده به بافر PW1 و بافر PW2 اضافه کنید.

• قبل از شروع استخراج انکوباسیون یا حمام آب را تا دمای °C 60 گرم کنید.

1. قبل از شروع استخراج اتانول مطلق در دمای °C 20- ذخیره کنید.

روش استخراج:

1. mg10-15 بافت را در یک میکروتیوب ml2 وزن کرده و μl 400   از محلول  PT buffer  به آن اضافه کنید. میکروتیوب را چند بار سروته کرده و  بمدت چند ثانیه ورتکس کنید.
2. μl 20 میکرولیتر پروتئیناز K به محلول اضافه کرده و بمدت 15 ثانیه بخوبی ورتكس‌ کنید. سپس مخلوط حاصله را به مدت 30-20 دقیقه در دمای °C 60 انکوبه کنید. (در طی انکوباسیون، میکروتیوب هر چند دقیقه یکبار به آرامی تكان داده می شود تا لیز سلولی به خوبی صورت گیرد).
3. پس از مدت زمان انکوباسیون روی محلول حاصله، μl 500 از محلول PB Buffer بریزید و به آرامی میکروتیوب را سر و ته کنید.( توجه کنید اگر پس از اضافه کردن PB Buffer داخل میکروتیوب رسوب بافت باقی ماند ، میکروتیوب را بمدت 2-1 دقیقه در دمای °C 60 انکوبه کنید تا بقیه رسوبات حل شوند).
4. محلول حاصله را به ستون جداسازی که در داخل تیوب جمع کننده قرار دارد منتقل کنید و پس از آن در سانتریفیوژ با سرعت rpm 12000 بمدت 1 دقیقه قرار دهید.
5. مایع جمع شده در تیوب جمع کننده را دور ریخته و ستون را مجددا در تیوب جمع کننده قرار دهید و از محلول PW1 buffer به میزان μl 700 به ستون اضافه کنید و آن را بمدت 2 دقیقه با سرعت rpm 10000 سانتریفیوژ کنید.
6. پس از سانتریفیوژ مایع جمع شده در تیوب جمع کننده را دور ریخته و μl 500 از محلول PW2 buffe  را به ستون اضافه کنید و آن را بمدت 2 دقیقه با سرعت rpm 10000 سانتریفیوژ کنید.
7. ستون را مجددا در تیوب جمع کننده قرار دهید و بدون اضافه نمودن هیچ گونه محلولی آن را با سرعت rpm14000 بمدت 3 دقیقه سانتریفیوژکنید.
8. ستون را به داخل یک میکروتیوب 5/1 میلی لیتری انتقال دهید و به مقدار μl 30 الی μl 100 از PE buffer اضافه کنید و بمدت 10-5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
9. تیوب را بمدت 3 دقیقه با سرعت rpm 13000 سانتریفیوژ کنید، سپس ستون را دور انداخته و مایع جمع شده در میکروتیوب را که حاوی DNA است در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

توجه: برای حذف مقادیر احتمالی RNA ، μl 4 آنزیم RNase A با غلظت mg/ml10 ( از اجزای کیت نمی باشد) را در مرحله 2 قبل از اضافه کردن پروتئیناز K اضافه کنید و جند ثانیه ورتکس کرده، سپس مرحله 2 را ادامه دهید.