کیت استخراج DNA گیاهی 50 Test

قبل از اولین استفاده:

• مقدار ml34 اتانول (96-100) درصد به محلولPW1 Buffer  و  ml47 به محلول PW2 Buffer اضافه کنید و سپس لیبل روی ظرف ها را علامت گذاری کنید.
• قبل از اولین استفاده ml1 از محلول پروتئیناز K یا ml1 از ddH₂O را به ویال حاوی پروتئیناز K اضافه کنید و سپس به آرامی ویال را ورتکس کرده تا محلول به خوبی حل گردد.

نکات مهم:

1. ویال پروتئیناز K را در دمای -20°C نگهداری کنید. قبل از اولین استفاده حجم مورد نیاز محلول پروتئیناز K را به ویال پروتئیناز K اضافه کنید. سپس ورتکس کرده و مطمئن شوید که پروتئیناز K کاملاً حل شده است.
2. حجم مورد نیاز اتانول (96-100) درصد را در اولین استفاده به بافر PW1 و بافر PW2 اضافه کنید.

• قبل از شروع استخراج انکوباسیون یا حمام آب را تا دمای °C 60 گرم کنید.

1. قبل از شروع استخراج اتانول مطلق در دمای °C 20- ذخیره کنید.

روش استخراج:

1. μl 450 از محلول PP1 buffer به میکروتیوب ml2 اضافه کنید.( برای گونه هایی همچون کاج که حاوی پلی ساکارید بالایی هستند μl 600 از محلول PP buffer اضافه کنید).
2. مقداری بافت گیاهی داخل هاون ریخته و کامل خرد کنید. یا مقداری بافت گیاه را داخل فویل آلومینیومی در نیتروژن مایع قرار داده ، سپس داخل هاون کاملا پودر کنید. سپس اگر بافت مورد نظر خشک باشد mg 20-40 ، یا اگر بافت تازه باشدmg 80-100 برداشته و داخل میکرو تیوب ml2 که از قبل لیز بافر اضافه شده، بریزید (توجه داشته باشید که از ریختن مستقیم ازت مایع روی بافت مورد نظر بپرهیزید).
3. میکروتیوب را چند بار سروته کرده و بمدت چند ثانیه ورتکس کنید.
4. μl 450 از محلول PP2 buffer و 20 میکرولیتر پروتئیناز K به محلول اضافه کرده و به­خوبی ورتكس‌ کنید. سپس مخلوط حاصله به مدت30 دقیقه در دمای 60 درجه انکوبه کنید. در طی انکوباسیون، میکروتیوب هر چند دقیقه یکبار به آرامی تكان داده می شود تا لیز سلولی به خوبی صورت گیرد
5. پس از مدت زمان انکوباسیون میکروتیوب را در سانتریفیوژ با سرعت rpm 14000 بمدت 5 دقیقه قرار دهید.
6. پس از سانتریفیوژ محلول رویی را به آرامی برداشته و به میکروتیوب ml2 دیگر منتقل کنید.
7. روی محلول حاصله، μl 500 از محلول PB Buffer بریزید و به آرامی میکروتیوب را سر و ته کنید.
8. مقدار μl 550 اتانول مطلق سرد روی محلول حاصله بریزید، سپس میکروتیوب را بمدت 5 الی 10 ثانیه سر و ته کرده و μl 600 محلول حاصله را به ستون جداسازی که در داخل تیوب جمع کننده قرار دارد منتقل کنید و پس از آن در سانتریفیوژ با سرعت rpm 12000 بمدت 30 ثانیه قرار دهید.
9. باقیمانده ی محلول حاصله را در دو مرحله به ستون جداسازی که در داخل تیوب جمع کننده قرار دارد منتقل کنید و پس از آن دوباره در سانتریفیوژ با سرعت rpm 12000 بمدت 30 ثانیه قرار دهید.
10. مایع جمع شده در تیوب جمع کننده را دور ریخته و ستون را مجددا در تیوب جمع کننده قرار دهید و از محلول PW1 buffer به میزان μl 700 به ستون اضافه کنید و آن را بمدت 2 دقیقه با سرعت rpm 10000 سانتریفیوژ کنید.
11. پس از سانتریفیوژ مایع جمع شده در تیوب جمع کننده را دور ریخته و μl 500 از محلول PW2 buffe  را به ستون اضافه کنید و آن را بمدت 2 دقیقه با سرعت rpm 10000 سانتریفیوژ کنید.
12. مرحله ی 11 را دوباره تکرار کنید.
13. ستون را مجددا در تیوب جمع کننده قرار دهید و بدون اضافه نمودن هیچ گونه محلولی آن را با سرعت rpm14000 بمدت 3 دقیقه سانتریفیوژکنید.
14. ستون را به داخل یک میکروتیوب 5/1 میلی لیتری انتقال دهید و به مقدار μl 30 الی μl 100 از PE buffer اضافه کنید و بمدت 10-5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
15. تیوب را بمدت 3 دقیقه با سرعت rpm 13000 سانتریفیوژ کنید، سپس ستون را دور انداخته و مایع جمع شده در میکروتیوب را که حاوی DNA است در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

توجه: برای حذف مقادیر احتمالی RNA ، μl 4 آنزیم RNase A با غلظت mg/ml10 ( از اجزای کیت نمی باشد) را در مرحله 4 قبل از اضافه کردن پروتئیناز K اضافه کنید و جند ثانیه ورتکس کرده، سپس بقیه مراحل را ادامه دهید.