تریپسین یک سرین پروتئاز بدست آمده از پانکراس خوک است که بطور گسترده برای جدا کردن سلول های چسبیده، پاساژ دادن سلول­ها، و همچنین جدا کردن اولیه سلول ها از هم استفاده می شود. غلظت تریپسین مورد نیاز برای جدا کردن سلول ها، به نوع سلول و نیازهای آزمایشگاهی بستگی دارد. به منظور افزایش فعالیت تریپسین، اغلب EDTA به عنوان عامل شلاته کننده افزوده می شود. ایده زیست دو غلظت از Trypsin-EDTA شامل 0.05 درصد و 0.25 درصد ارائه می دهد…

شرح محصول

تریپسین، سرین پروتئازی است که از پانکراس خوک گرفته می شود. این آنزیم یک پروتئین تک زنجیره حاوی223 اسید آمینه است که محل اصلی فعالیت آن زنجیره جانبی دارای لیزین و آرژنین با بار مثبت است. تریپسین غالبا زنجیره های پپتیدی را از سمت عامل کربوکسیل لیزین و آرژنین می شکند (مگر اینکه بعد از آنها پرولین قرار داشته باشد). تریپسین بطور شایع برای جدا کردن سلول های چسبیده به فلاسک محیط کشت و همچنین جدا کردن سلول ها از هم استفاده می شود. تریپسین همچنین می تواند باعث شکست پیوندهای استری و آمیدی در مشتقات سنتتیک اسیدهای آمینه شود. همچنین EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) به عنوان عامل شلاته کننده اغلب برای افزایش فعالیت آنزیماتیک تریپسین افزوده می شود. EDTA از طریق خنثی کردن یونهای کلسیم و منیزیم که باعث افزایش اتصال سلول به سلول می شوند عمل می کند.

ویژگی ها

• این محصول، تریپسین 0.25 درصد و EDTA در بافر فسفات سالین دالبکو است.
• این محصول حاوی بیکربنات سدیم و فنل رد در HBSS است.

نکات

• مهارکننده های سرین پروتئاز، مانند DFP، TLCK، APMSF، AEBSEF، و آپروتینین، تریپسین را مهار می کنند.
• غلظت تریپسین مورد نیاز برای جدا کردن سلولها از سوبسترا، ابتدائا به نوع سلول، سن کشت، و تراکم کشت های سلول بستگی دارد.
• این محصول بصورت منجمد در دمای 10- تا 40- درجه سانتیگراد نگهداری می شود. از فریز و ذوب کردن مکرر اجتناب کنید.
• این محصول حاوی فنل رد است. به دلیل اینکه بر روی یخ خشک منتقل می شود ممکن است مقدار قابل توجهی دی اکسید کربن در داخل بسته باشد. این دی اکسید کربن ممکن است به محلول نفوذ کرده و pH آن را کمی کاهش داده و باعث تغییر رنگ آن از صورتی به نارنجی شود. محلول نارنجی هنوز قابل استفاده است، یا می توان با بیکربنات سدیم pH آن را تنظیم کرد.
• انکوبه کردن مدت طولانی سلول ها با غلظت های خیلی بالای تریپسین می تواند باعث آسیب به غشاء سلولی و در نتیجه مرگ سلول شود.
• محلول کردن تریپسین یا رقیق سازی آن از یک محلول غلیظ، باید با یک محلول نمک بافری فاقد کلسیم یا منیزم انجام شود.
• محلول های تریپسین باید شفاف و عاری از هر گونه ذرات معلق باشد. در صورتی که محلول کدر بوده یا حاوی ذراتی معلق و یا رسوب است از آن استفاده نکنید. شواهد دیگر تخریب، شامل کاهش خصوصیات فیزیکی یا عملکردی است.

روش استفاده

قبل از اجرای هر گونه پروتوکل، غلظت مناسب محلول تریپسین-EDTA (0.05 درصد با شماره کاتالوگ BI-1601، یا 0.25 درصد با شماره کاتالوگ BI-1602) و همچنین زمان انکوباسیون لازم برای جداسازی را بصورت تجربی برای رده های سلولی مورد نظر خود تعیین کنید. غالبا زمان لازم برای جداسازی سلول ها از سطح، به نوع سلول، تراکم سلولی، پتانسی تریپسین، غلظت سرم در محیط رشد، و فاصله زمانی از آخرین ساب کالچر بستگی دارد.

• با استفاده از پیپت، محیط استفاده شده را از ظرف کشت خارج کنید.
• با افزودن بافر نمکی متعادل (PBS) فاقد کلسیم و منیزیم (BI-1401) به کناره فلاسک در سمت مقابل سلولها، تک لایه سلولی را شستشو دهید.
• با تکان دادن آهسته فلاسک به مدت 1 تا 2 دقیقه، لایه سلولی را شستشو داده و محلول شستشو را دور بریزید.
• محلول تریپسین-EDTA 25% ( (BI-1602) را از سمت مقابل سلولها به کناره فلاسک بیفزایید.، میزان محلول تریپسین مورد استفاده باید به اندازه ای باشد که روی لایه سلولی را بپوشاند.
• فلاسک را به آرامی تکان داده تا مطمئن شوید که محلول جداسازی، کل لایه سلولی را پوشانده است.
• فلاسک را به مدت 2 تا 3 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. روند جداسازی را با قرار دادن فلاسک زیر میکروسکوپ اینورت بررسی کنید. زمانی که جداسازی کامل شود، سلول ها معلق بوده و گرد به نظر می رسند. علاوه بر تکان دادن آرام، در مورد فلاسک های رده سلولی که بطور مشخص جداسازی آنها از لایه زیرین مشکل است ضربه زدن باعث تسریع جداسازی می شود.

نکته: توجه داشته باشید که زمان دقیق مورد نیاز برای جداسازی سلول ها، بر اساس رده سلولی متفاوت است. فرایند جداسازی باید پیوسته کنترل و نظارت شود تا از آسیب سلول ها جلوگیری شود.

• به محض تکمیل جداسازی سلول، سرم حاوی محیط کامل را به فلاسک بیفزایید تا تریپسین را مهار کرده و از تخریب بیشتر سلول ها جلوگیری کند.
• سلول ها را با پیپت کردن مکرر از هم جدا کرده و بصورت یک سوسپانسیون سلولی واحد درآورید.
• سلول ها را شمارش کرده و ساب کالچر دهید.